유전자 돌연변이와 PCR원리

DNA 돌연변이는 DNA의 뉴클레오티드 서열을 변화시키는 것이다. 수리나 복구가 되지 않는 경우에는 다음 세대로 전해질 수 있다. 돌연변이는 다양한 원인에 의해서 일어난다.

 

1. 돌연변이가 일어나는 세포

-Somatic Mutations (체세포 돌연변이) : 체세포에 일어나는 돌연변이는 다음 세포로는 전해지지만 다음 세대로는 전해지지 않는다. 단, 식물에서는 예외도 있다.

-Germline Mutations (생식세포 돌연변이) : 생식세포에 일어나는 돌연변이는 배우체 유전자에 변화가 일어나기 때문에 다음 세대로 전해지게 된다.

 

*거의 모든 생명체의 유전체에는 단백질 합성에 직접 이용되는 서열 부위 (coding regions)와 직접적으로 이용되지 않는 서열 부위 (non-coding regions)가 존재한다.

 

 

 

 

 

 

2. 돌연변이 표현 여부 종류

- Silent Mutations (침묵 돌연변이) : DNA 서열에는 변화가 있지만 단백질의 서열 (기능)에는 변화가 없다. Noncoding 부위에 변화가 생겼거나, 염기서열의 변화가 단백질 서열의 변화를 일으키지 않는 경우를 말한다.

- Missense Mutations (미스센스 돌연변이) : DNA 서열 변화 때문에 아미노산 서열에 변화 초래한다.

- Nonsense Mutations (넌센스 돌연변이) : DNA 서열의 변화 때문에 종결 코돈으로 바뀌게 된다. 그 후 단백질 합성의 조기 종결된다.

- Frameshift Mutations (프레임 시프트 돌연변이) : DNA 서열 내에 하나 혹은 그 이상의 염기가 삽입되거나 아니면 소실된다. 이후 아미노산 서열의 변화가 생긴다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. 돌연변이 기능 변화 종류

- Loss-of-function Mutations (기능 상실 돌연변이) : DNA 서열 변화 때문에 단백질 기능(서열)에 변화가 일어난다. 단백질 혹은 효소로서의 기능을 하지 못한다. 거의 항상 열성으로 유전된다.

- Gain-of-function Mutations (기능 획득 돌연변이) :  DNA 서열 변화 때문에 단백질의 기능(서열)에 변화가 일어난다. 단백질 혹은 효소의 기능이 바뀌거나 활성이 증가하며 보통 우성으로 유전된다.

- Conditional Mutations (조건부 돌연변이) : 허용 조건 (permissive)에서는 DNA 서열 변화가 표현되지 않지만, 제한조건 (restrictive)에서는 DNA 서열 변화가 표현형의 변화로 나타난다. 대표적인 예로는 온도 민감성 돌연변이 (temperature-sensitive mutations)가 있다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. 돌연변이 범위

- Point Mutations (점 돌연변이) : 단일 뉴클레오티드의 결실 (deletion), 삽입 (insertion) 및 치환 (substitution)에 의해 일어나는 돌연변이다. Point mutations (점 돌연변이)는 단일 뉴클레오티드 변화에 의해 생기는 돌연변이로서 복제과정에서의 에러나 돌연변이원 (mutagens)에 의해 생긴다. DNA coding region에 일어난 점 돌연변이는 mRNA 서열에도 변화를 일으키지만, 단백질의 구조나 기능에 변화를 일으키지 않는 경우도 있다. 반대로 단일염기의 변화임에도 불구하고 단백질의 구조나 기능에 큰 변화를 초래하는 경우도 있다. Sickle-cell disease (Hb S) 종양억제 유전자 TP53 (p53)의 기능 획득 돌연변이가 대표적인 예다.

- Chromosome Mutations (염색체 돌연변이) : 염색체 일부분이 소실, 복제가 되면서 일어나는 돌연변이다.

 

- Deletions (결실) : 일부 유전정보가 소실되기 때문에 심각하거나 치명적인 결과가 일어날 수 있다.

- Duplications (중복) : 상동염색체 사이에 재조합이 일어날 때 다른 부위에서 breaking이 일어나는데, 재조합이 잘못되는 경우에 하나의 염색체에는 copy 2개가 들어가고 다른 염색체에는 아무것도 없는 경우가 생길 수 있다.

- Inversions (역위): breaking과 rejoining이 일어날 때 염색체 일부분이 앞-뒤가 바뀌는 경우가 생길 수 있다.

- Translocations (전좌): 어떤 염색체의 일부분이 떨어져서 다른 염색체로 가서 부착되는 경우가 생길 수 있는데 이런 경우에는 중복이나 소실이 일어나게 된다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. 돌연변이 발생원인

-Spontaneous Mutation (자연발생적 돌연변이) : 외부 영향이 아닌 내부 원인으로 생기는 돌연변이 DNA 복제과정에서 DNA 중합효소에 의해 일어난 에러다. 10^-7~10^-8 정도의 에러율을 가지고 있다. 대부분 복구되지만 일부는 영구적으로 변화를 일으키며 뉴클레오티드 염기 구조의 변화 (예, tautomer)에 의한 잘못된 염기쌍의 형성이 일어난다. 또한, 염기의 자발적 화학변화 (예, deamination)에 의한 잘못된 염기쌍의 형성이 일어난다. 그리고 불완전 감수분열 (상동염색체의 nondisjunction)에 의한 무작위적 염색체 절단 및 재연결에 의한 유전자 서열의 변화가 생긴다.

- Induced Mutation (유도 돌연변이) : 외부요인 (돌연변이원; mutagens)에 의해 생기는 돌연변이다. Nitrous acid는 탈아미노화 (deamination)에 의한 잘못된 염기쌍이 형성된다. Benzopyrene (벤조피렌)은 guanine 염기에 chemical group을 결합시킴으로써 염기쌍이 형성되지 못하게 한다. Ionizing radiation (X-ray 등)은 자유라디칼 (free radicals)을 생성하여 염기를 손상시키거나 당-인산 골격을 파괴한다. UV radiation (햇빛 혹은 일광욕)은 thymine에 흡수되면 인접 뉴클레오시드와 공유결합을 만들 수 있다. (예, T=T dimer) 이는 DNA 복제를 억제한다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

*유전체 서열을 보면 특정부위에서 돌연변이가 빈번하게 일어나는 것이 관찰된다. 이를 Mutation Hotspots이라고 한다.  5-methylcytosin이 아미노기를 잃게 되면 thymine으로 변환 복구 과정에서 50% 정도만 교정될 수 있다.

- 손상복구(Proofreading and Repair)는 DNA 복제과정에서 발생하는 에러 및 돌연변이는 생명체에 위해를 가하는 경우가 많아서 이를 최소화시키고 복구시키는 교정 메커니즘이 있어야만 생명체 유지가 가능하다.

-Proofreading (교정) : DNA polymerase가 교정 기능을 수행하는데 DNA 합성 시 에러를 인지하게 되면 (잘못된 뉴클레오티드가 도입되는 경우) DNA polymerase가 이를 즉시 제거하고 다시 정상 뉴클레오티드를 도입하게 된다. 복제과정에서 DNA polymerase의 에러율은 약 1/10,000 정도로 매우 낮으며 생체 내에서는 더 낮아서 최대 1/1,000,000,000 정도의 에러율을 보인다.

-Mismatch repair (불화합 수선) : 불화합 수선 메커니즘은 잘못된 염기쌍 (mismatch)을 체크할 때 DNA 메틸화를 이용하는 방법이다. 기존의 DNA 가닥은 메틸화 (methylated), 새로 만들어진 DNA 가닥은 일시적으로 비메틸화(unmethylated)하여 구분 잘못된 염기쌍이 있는 지를 검사하고 이를 제거 후 수선한다.

-Excision repair (절제 수선) : 절제 수선 (excision repiar)은 세포의 전 주기에 걸쳐서 일어나는데, 이를 통해 다양한 원인 (화학물질, 방사선 등)에 의해 생기는 돌연변이를 검출하고 제거한다. 절제 수선 효소 (nuclease)가 돌연변이 부분을 인식하고 이를 절제해내면, 이어서 DNA polymerase와 DNA ligase가 작용해서 손상부위를 복구한다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Polymerase Chain Reaction (PCR)

-원하는 DNA 단편(서열)만 선택하여 증폭하는 방법이다.

-극미량 샘플로도 가능하고 빠른 속도와 높은 선택성을 가진다.

-증폭할 DNA, primer set (forward-reverse), dNTP, DNA polymerase, buffer, salt (MgCl2) Primers , Heat-stable DNA Polymerase가 PCR재료로 필요하다.

-온도를 올려서 증폭하고자 하는 샘플의 DNA 가닥을 분리한다.

-온도를 내리면서 타겟 유전자 서열에 primer가 결합한다.

-고온에서 안정적으로 활성 가능한 DNA 합성효소를 이용하면 빠른 시간 내 타겟 유전자 복제 가능하다.